2-Photonen-Mikroskopie
2PLSM-Anlage im iba
2PLSM-Anlage
Chondrozyten auf einem Kollagen-Zellträger. A: Intensitätsbild der Autofluoreszenz, B: Falschfarbenzuweisung anhand der spektralen Unterschiede zwischen den Zellen und dem Trägermaterial (spectral unmixing: grün: Kollagenträgermaterial, rot: Chondrozyten)
Chondrozyten auf Kollagenträger

Die Nutzung des 2-Photoneneffektes zur Anregung fluoreszierender Moleküle (Jablonski-Schema) wird insbesondere für die Fluoreszenzmikroskopie von dreidimensionalen biologischen Zellpopulationen und Geweben genutzt. Wässrige Medien weisen im Wellenlängenbereich um 800 nm keine Absorption auf. Weiterhin wird bei Einstrahlung langwelligen Anregungslichtes eines Ti:Sa-Lasers (ca. 790 nm, 5-15 mW im Fokus) das Licht weniger stark durch die Gewebe absorbiert als kürzerwelliges Licht. Wird eine biologische Probe dreidimensional Ebene für Ebene gescannt (Laserscannende 2-Photonen-Mikroskopie, 2PLSM), kann eine dreidimensionale Abbildung bis in Tiefen von mehr als 500 µm erreicht werden. Im iba Heiligenstadt werden vornehmlich nicht fluoreszenzmarkierte, native Proben auf der Basis ihrer Autofluoreszenz analysiert. Dies erlaubt die online-Analyse zu jedem Zeitpunkt des Inkubationsprozesses ohne Beeinflussung der biologischen Proben. Bei Belichtungszeiten einer CCD-Kamera von ca. 0,5 - 2,5 sec pro Objektebene ist die Intensität der Autofluoreszenz ausreichend, um mittels 3D-Rendering quantitative Auswertungen an 3D-Proben vornehmen zu können. Unterstützt wird eine selektive Auswertung verschiedener Komponenten innerhalb einer Probe (z.B. Zellen und Zellträgermaterialien) durch die spektrale Autofluoreszenzdetektion in jedem Pixel (spectral unmixing) sowie durch die Analyse und Darstellung der Fluoreszenzabklingzeit (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM). Durch die softwaregestützte quantitative Analyse können u.a. die Zellzahl, die Zellverteilung und die Zellmigration über die Zeit (4D-Scan) erfasst werden.

Vorteile der 2P-Mikroskopie gegenüber der Ein-Photonenanregung (z.B. CLSM)

  • schonende nichtinvasive Analyse von Zellen und Geweben
  • effiziente Anregung von Autofluoreszenz
  • geringe Fotoschädigung beim 3D-Scan einer Probe
  • Minimierung von Bleicheffekten
  • Analyses biologischer Gewebe und 3D-Zellkulturen bis in eine Tiefe von 1 mm aufgrund der langwelligen Anregungsstrahlung
  • hohe Sensitivität, da die gesamte Fluoreszenzstrahlung zur Bildgebung beiträgt

Applikationen

  • online-Mikroskopie an 3D-Proben des Tissue Engineerings
  • Untersuchungen an Knorpelgewebeproben
  • online-Biofilmanalysen
  • photoinduzierte Freisetzung von Wirksubstanzen
Fliesskammer mit online-2PLSM und hydrostatischer Zellstimulation für das Knorpel-Tissue Engineering
Fliesskammer mit online-2PLSM